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標簽: 實時 熒光定量PCR realtime PCR 本生生物
所謂實時熒光定量 PCR 技術(shù),是指在 PCR 反應(yīng)體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR 進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
原理及材料:
實驗材料:細胞樣品
試劑、試劑盒:RNA 提取試劑盒 熒光定量 PCR MixTRIZOL dNTP lf 仿 逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV ybc Taq 酶 DEPC 水 ddH2O TE MgCl2 瓊脂糖 溴化乙錠 MOPS jiaquan 乙酸鈉 EDTA EB 溴酚蘭
儀器、耗材:離心管 離心機 風光光度計 電泳槽 凝膠板 Realtime PCR 儀
實驗步驟:
一、 樣品 RNA 的抽提
1. 取凍存已裂解的細胞,室溫放置 5 分鐘使其溶解。
2. 兩相分離 每 1 ml 的 TRIZOL 試劑裂解的樣品中加入 0.2 ml 的 lf,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體 15 秒后,15 到 30℃孵育 2 到 3 分鐘。4℃下 12 000 rpm 離心 15 分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚 lf 相,中間層以及無色水相上層。RNA 全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的 TRIZOL 試劑的 60%。
3. RNA 沉淀 將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無 RNA 酶的離心管中。加等體積 ybc 混合以沉淀其中的 RNA,混勻后 15 到 30℃孵育 10 分鐘后,于 4℃下 12 000 rpm 離心 10 分鐘。此時離心前不可見的 RNA 沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA 清洗 移去上清液,每 1 mlTRIZOL 試劑裂解的樣品中加入至少 1 ml 的 75% 乙醇(75% 乙醇用 DEPCH2O 配制),清洗 RNA 沉淀?;靹蚝?,4℃下 7 000 rpm 離心 5 分鐘。
5. RNA 干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,使 RNA 沉淀在室溫空氣中干燥 5-10 分鐘。
6. 溶解 RNA 沉淀 溶解 RNA 時,先加入無 RNA 酶的水 40μl 用槍反復吹打幾次,使其溶解,獲得的 RNA 溶液保存于 - 80℃待用。
二、 RNA 質(zhì)量檢測
1. 紫外吸收法測定
先用稀釋用的 TE 溶液將分光光度計調(diào)零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計 260nm 和 280nm 處的吸收值,測定 RNA 溶液 濃度和純度。
(1)濃度測定
A260 下讀值為 1 表示 40 μg RNA/ml。樣品 RNA 濃度 (μg/ml) 計算公式為:A260 × 稀釋倍數(shù) × 40 μg/ml。具體計算如下:
RNA 溶于 40 μl DEPC 水中,取 5 μl,1:100 稀釋至 495 μl 的 TE 中,測得 A260 = 0.21
RNA 濃度 = 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl
取 5 ul 用來測量以后,剩余樣品 RNA 為 35 μl,剩余 RNA 總量為:
35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg
(2)純度檢測
RNA 溶液的 A260/A280 的比值即為 RNA 純度,比值范圍 1.8 到 2.1。
2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定
(1)制膠
1 g 瓊脂糖溶于 72 ml 水中,冷卻至 60℃,10 ml 的 10× MOPS 電泳緩沖液和 18 ml 的 37% jq 溶液 (12.3 M)。
10×MOPS 電泳緩沖液
濃度 成分
0.4 M MOPS,pH 7.0
0.1 M 乙酸鈉
0.01 M EDTA
灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入 25 μl 溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內(nèi),加足量的 1×MOPS 電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。
(2)準備 RNA 樣品
取 3 μgRNA,加 3 倍體積的 jq 上樣染液,加 EB 于 jq 上樣染液中至終濃度為 10 μg/ml。加熱至 70℃孵育 15 分鐘使樣品變性。
(3)電泳
上樣前凝膠須預電泳 5 min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm 電壓下 2 h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少 2-3 cm。
(4)紫外透射光下觀察并拍照
28S 和 18S 核糖體 RNA 的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提 RNA 的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的 2 倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的 RNA(tRNA 和 5S 核糖體 RNA)組成。在 18S 和 28S 核糖體帶之間可以看到一片彌散的 EB 染色物質(zhì),可能是由 mRNA 和其它異型 RNA 組成。RNA 制備過程中如果出現(xiàn) DNA 污染,將會在 28S 核糖體 RNA 帶的上面出現(xiàn),即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶,RNA 的降解表現(xiàn)為核糖體 RNA 帶的彌散。用數(shù)碼照相機拍下電泳結(jié)果。
三、樣品 cDNA 合成
1. 反應(yīng)體系
序號 反應(yīng)物 劑量
1 逆轉(zhuǎn)錄 buffer 2 μl
2 上游引物 0.2 μl
3 下游引物 0.2 μl
4 dNTP 0.1 μl
5 逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 0.5 μl
6 DEPC 水 5 μl
7 RNA 模版 2 μl
8 總體積 10 μl
輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm 短暫離心。
2. 混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶 MMLV 之前先 70℃干浴 3 分鐘,取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致,然后加逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μl,37℃水浴 60 分鐘。
3. 取出后立即 95℃干浴 3 分鐘,得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為 cDNA 溶液,保存于 - 80℃待用。
四、 梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量 PCR
1. β-actin 陽性模板的標準梯度制備 陽性模板的濃度為 1011,反應(yīng)前取 3 μl 按 10 倍稀釋(加水 27 μl 并充分混勻)為 1010,依次稀釋至 109、108、107、106、105、104,以備用。
2. 反應(yīng)體系如下:
標準品反應(yīng)體系
序號 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 陽性模板上游引物 F 0.5 μl
3 陽性模板下游引物 R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq 酶 1 μl
6 陽性模板 DNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 總體積 50 μl
輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm 短暫離心。
3. 管家基因反應(yīng)體系:
序號 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 μl
2 內(nèi)參照上游引物 F 0.5 μl
3 內(nèi)參照下游引物 R 0.5 μl
4 dNTP 0.5 μl
5 Taq 酶 1 μl
6 待測樣品 cDNA 5 μl
7 ddH2O 32.5 μl
8 總體積 50 μl
輕彈管底將溶液混合, 6000 rpm 短暫離心。
3. 制備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應(yīng)條件為:93℃ 2 分鐘,然后 93℃ 1 分鐘,55℃ 2 分鐘,共 40 個循環(huán)。
五、 制備用于繪制梯度稀釋標準曲線的 DNA 模板
1. 針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的 cDNA 模板進行 PCR 反應(yīng)。
2. 反應(yīng)體系
序號 反應(yīng)物 劑量
1 10× PCR 緩沖液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物 F 0.5 ul
4 下游引物 R 0.5 ul
5 dNTP 混合液 3 ul
6 Taq 聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至總體積為 25 ul
輕彈管底將溶液混合,6000rpm 短暫離心。
35 個 PCR 循環(huán)(94℃1 分鐘;55℃1 分鐘;72℃1 分鐘); 72?C 延伸 5 分鐘。
(3)PCR 產(chǎn)物與 DNA Ladder 在 2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測 PCR 產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
(4)將 PCR 產(chǎn)物進行 10 倍梯度稀釋:將 PCR 產(chǎn)物進行 10 倍梯度稀釋:設(shè)定 PCR 產(chǎn)物濃度為 1×1010,依次稀釋至 109、108、107、106、105、104 幾個濃度梯度。
六、 待測樣品的待測基因?qū)崟r定量 PCR
1. 所有 cDNA 樣品分別配置實時定量 PCR 反應(yīng)體系。
2. 體系配置如下:
序號 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq 聚合酶 2 ul
6 待測樣品 cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合,6 000 rpm 短暫離心。
(3)將配制好的 PCR 反應(yīng)溶液置于 Realtime PCR 儀上進行 PCR 擴增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:93℃ 2 分鐘預變性,然后按 93℃ 1 分鐘,55℃1 分鐘,72℃1 分鐘,共 40 做個循環(huán),最后 72℃7 分鐘延伸。
七、 實時定量 PCR 使用引物列表
引物設(shè)計軟件:Primer Premier 5.0,并遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);引物不在模板的非目的位點引發(fā) DNA 聚合反應(yīng) (即錯配)。
八、電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進行 Realtime PCR 反應(yīng)。PCR 產(chǎn)物與 DNA Ladder 在 2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView 染色,檢測 PCR 產(chǎn)物是否為單一特異性擴增條帶。
注:僅供參考!
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